qEV尺寸排阻分离柱是由新西兰IZON公司研发和生产的一种基于尺寸排阻法色谱法（Size Exclusion Chromatography, SEC）原理的外泌体分离-纯化技术。该技术具有简便、快速、容易标准化操作的特点，只需要15min就可以从多种类型样本中提取到完整的高纯度外泌体。并且相较于其他方法，qEV所提取的外泌体纯度更高、浓度更高、活性也更高，还可以重复使用。qEV分离的外泌体尤其适用于外泌体蛋白组和外泌体功能实验之用。

 

 

 

|   qEV尺寸排阻外泌体分离柱-原理

        qEV是基于分子排阻法SEC原理，按照分子粒径进行分段分离的方法。将生物样品流经具有固定孔隙的SEC填充物，吸附粒径较小的分子如蛋白、脂类等，而较大粒径的分子或颗粒不能进入孔隙。在缓冲液的作用下，较大粒径的囊泡（外泌体）流速快，在特定的阶段会被洗脱出来进入样品收集管，成为实验样品，而小分子物质则需要更长的洗脱时间，最终在特定时间流入废液缸。

|   qEV尺寸排阻外泌体分离柱-操作流程（点击观看视频）

1. 用洗脱缓冲液冲洗柱子。

2. 装入500μL样品。

3. 最开始的3ml是空隙体积，继续向分离柱中添加PBS以洗脱囊泡（外泌体）。

4. 收集空隙体积后的1.5mL液体为高纯度外泌体。

|   qEV尺寸排阻外泌体分离柱-优势

 ●   高纯度：去除99%以上的可溶性蛋白质，去除95%以上高密度脂蛋白

 ●   无损伤：保持细胞外囊泡的完整性和生物功能

 ●  标准化：每根分离柱均经过标准化、质量保证，并通过ISO13485标准认证

 ●  可靠性：只要15min就可以得到完整外泌体样本，已经在大规模的实验室试验得到证实

 ●  适用性：适用于多种类型样品的外泌体提取，包括：血清、血浆、尿液、细胞上清、脑脊液、唾液等；尤其适用于外泌体功能研究中，用于细胞培养或动物注射的高纯度外泌体的获得

       如上图所示，血清样品中收集的组分，用qNano其进行定量测量。在280纳米处用吸光度法测定蛋白质的相对浓度。数据表明，收集的第7至9组分具有最高浓度的囊泡(外泌体),而污染的血清蛋白洗脱的分数为第11至30组分(左图)。通过比较分离前和分离后的囊泡(外泌体)与蛋白质浓度比，第7组分的囊泡富集量为蛋白质的6000倍(右图)。根据样品的不同，如果下游分析分别需要更高的囊泡(外泌体)纯度或更高的囊泡(外泌体)产量，可将第7至9部分或第7至11部分汇集在一起。

|   qEV尺寸排阻外泌体分离柱-产品规格

qEV与超速离心技术的对比

案例1   尺寸排阻SEC比超离UC获取外泌体的纯度更高

       该文献通过对滑膜液经过相同的预处理后，分别使用超离、密度梯度离心和尺寸排阻进行外泌体的分离。并通过WB、TEM对其进行鉴定分析。

      上图中红框所示的ApoA-1是HDL的标志物，可以发现UC和DGC都无法有效去除HDL，而SEC的WB图中，外泌体标志物的出现和HDL标志物和血清白蛋白的出现几乎不存在时间上的重叠，所以SEC可以收集到比较纯净的外泌体。

       上图中超离电镜下的图像，不仅背景杂质多，而且发生了聚集现象，这种聚集会对下游分析产生较大不利影响。相比之下，SEC的背景纯净，外泌体特征明显。

案例2   尺寸排阻SEC比超离UC获取外泌体生物活性更强

       该实验研究了使用超离UC和尺寸排阻SEC分离的心肌祖细胞(HMECs)培养液的外泌体的功能可能的差异。通过外泌体刺激细胞，诱导EKR磷酸化，然后通过比较外泌体刺激后的pEKR和EKR的比率，来评价不同分离方法制备外泌体的功能活性。

      上图WB显示，在相同条件下，无论总蛋白量变化还是粒子数变化，用SEC的方法比超离他的pERK / ERK比率更高，表明SEC收集到的外泌体具有更高的生物活性。

案例3 尺寸排阻SEC比超离UTC更适合进行血浆外泌体蛋白质组学分析

       该文献通过高分辨质谱分析，比较了SEC和UTC分离的血浆外泌体，在五次技术重复中鉴定的蛋白数量、信号强度等方面的差异。结果发现，相较于超离，SEC得到的外泌体，蛋白鉴定数量更多（图A，SEC 1,268±102，UTC 319±45），相同蛋白的定量CV值更小（图B，SEC 562种蛋白质的CV低于25%，而UTC只有73种蛋白质达到这一阈值）,且相同外泌体marker蛋白，SEC信号值普遍比UTC更高（图C）。

      上述几篇文献将尺寸排阻SEC与超离UC、密度梯度离心DGC在收集到外泌体的纯度、生物活性和得率方面作比较，通过实验数据、电镜图、WB图像，发现SEC相较于其他两种分离方法，获取的外泌体纯度更高、生物活性更强、更适合蛋白组学实验。

|   相关文献

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