药物分析

MEDICINE ANALYSIS
以高标准为核心宗旨，研究药物靶点筛选、信号通路磷酸化抗体芯片、外泌体提取

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发育生物学中的信号通路锁定

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发育生物学中的信号通路锁定

在发育的不同阶段，会涉及多条信号通路的变化，抗体芯片技术在筛选发育相关经典信号分子中拥有显著优势，可对加速发育生物学的研究进展起到重要的推动作用。

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随着人口老龄化的发展，老年疾病发病率越来越高，其中营养不良及相关疾病成为困扰老年人群体的普遍问题。由肠上皮细胞(IECS)和固有层组成的肠绒毛，是营养吸收的主要场所，肠绒毛的老化会导致营养吸收障碍的出现，但其老化机制尚不清楚。

上海交通大学发育与神经疾病遗传学重点实验室Bio-X研究所李保界教授团队通过灵活运用Cre-LoxP基因编辑小鼠技术和4008云顶国际生物提供的PEX100磷酸化广谱筛选抗体芯片技术，成功揭秘了mTORC1-p38MAPK-p53信号通路异常激活，引起肠绒毛老化的关键机制。同时，该研究还为治疗肠绒毛老化找到了关键靶点和候选小分子药物，相关研究结果于近期发表于国际权威学术期刊《NatureCommunications》, PMID: 31896747。

| 1. 寻找衰老导致营养吸收障碍的靶器官

研究人员采集了不同月龄的正常B6小鼠的小肠进行组织学观察，发现与3.5月龄的小鼠相比，17.5月龄的小鼠空肠近端和远端的绒毛高度和数量明显减少（图1a）。同时，17.5月龄小鼠对L-葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的营养吸收活性降低（图1b）。同时，研究人员还发现老年小鼠的隐窝高度和数量也有所减少（图1c），而隐窝中的肠干细胞(ISCs)和TA祖细胞控制着绒毛的大小和密度。这就说明衰老引起的肠绒毛大小和密度降低可能是由ISCs和TA细胞缺陷引起的。进一步，对不同月龄的小鼠施用电离辐射(IR)，2天后发现老年小鼠对电离辐射(IR)表现出更高的敏感性，其隐窝和增殖细胞的数量比年轻小鼠减少得更多，凋亡细胞也增加更多（图1d），说明老化的肠绒毛更加脆弱。综上，该阶段研究证实了衰老引起营养吸收障碍的靶器官主要在空肠绒毛隐窝区域。

图1 老年小鼠肠绒毛区域变化

| 2. 发现肠绒毛老化的关键蛋白mTORC1

前人研究证实mTOR通路的激活是机体衰老的关键因子，该蛋白是否也是导致肠绒毛老化的核心要素？研究人员先从Lgr5-GFP-CreERT小鼠的肠隐窝中分离Lgr5⁺的ISCs细胞，利用荧光显微镜观察mTROC1的指示剂p-S6蛋白的表达，发现相对于3.5月龄的小鼠，17.5月龄小鼠ISCs细胞中mTORC1的表达量显著升高（图2a）。为进一步证实，mTORC1蛋白对肠绒毛老化的影响，研究人员构建了仅在小肠中特异性敲除mTOR抑制子基因Tsc1的Cre-LoxP模型：Villin-Cre;Tsc1^f/f小鼠。观察发现，2-3月龄的Villin-Cre;Tsc1^f/f小鼠肠绒毛正常生长，但从7月龄开始，Villin-Cre;Tsc1^f/f小鼠的肠绒毛无论在绒毛高度还是密度方面均明显老化（图2c），伴随的是其营养物质吸收功能也显著退化（图2b）。而无论在ISCs细胞中还是在Villin-Cre;Tsc1^f/f小鼠模型中，雷帕霉素（RAP，mTOR的抑制剂）均能够一定程度逆转肠绒毛的老化现象。所有现象说明mTORC1蛋白在老龄小鼠肠绒毛老化过程中发挥着关键作用，而这种老化过程并非不可逆。

图2 mTOC1蛋白引起小鼠肠绒毛老化

| 3. 确定mTORC1调控肠绒毛老化中的关键信号通路

mTORC1通路是如何调控肠绒毛老化的呢？研究人员果断采用4008云顶国际生物提供的PEX100磷酸化广谱筛选抗体芯片技术，对Villin-Cre;Tsc1^f/f小鼠的小肠组织进行广泛的蛋白磷酸化筛选。抗体芯片迅速锁定了mTORC1下游一系列关键分子，其中p38MAPK蛋白的在Villin-Cre;Tsc1^f/f小鼠中上调7.21倍，尤为显著（图3a）。研究人员利用Westernblot证实了p38MAPK以及其上游的MKK6蛋白在Tsc1^−/−肠绒毛中显著上调（图3b），而RAP的施用可以逆转该现象。为进一步证实MKK6与p38MAPK的调控关系，在体外培养的MEFs细胞中，利用顺转siRNA的方式敲降MKK6后，发现p38MAPK的磷酸化变化受到了MKK6的调控，即说明MKK6是介于mTORC1和p38MAPK的中间信号转导蛋白。

图3 mTOC1对MKK6-p38MAPK通路的调控

通过进一步分析磷酸化抗体芯片数据，研究人员还发现p38MAPK下游的p53蛋白在Villin-Cre;Tsc1^f/f小鼠中也显著上调（图4a）。而前人研究也显示p53可能是承接p38MAPK信号导致肠绒毛老化的关键蛋白。通过构建Trp53^-/-小鼠模型，发现p53小肠条件敲除小鼠的肠绒毛也会表现出老化的症状，表现在肠绒毛大小和密度降低，营养吸收障碍等方面（图4b）。随后，研究人员将mTORC1和p38MAPK作为治疗靶点，利用RAP和小分子SB203580（p38MAPK的抑制剂）作为治疗药物，处理体外培养的从17.5月龄小鼠肠道分离的肠绒毛组织，发现RAP和SB203580均能够显著逆转老年小鼠肠绒毛隐窝数量减少的现象（图4d）。通过构建Mapk14^-/-小鼠模型，进一步证实了p38MAPK作为潜在治疗靶点的可能性（图4e）。

图4 构建肠绒毛老化的机制通路

综上，研究人员通过一系列的研究，逐步明确了mTROC1-MKK6-p38MAPK-p53通路在肠绒毛老化中发挥着关键作用（图4c），并为逆转肠绒毛老化，改善衰老引起的营养不良找到了潜在的治疗靶点和候选药物小分子。

| 小结

人口老龄化是严重的社会问题，本文作者依托经典的Cre-LoxP条件性敲除小鼠动物模型和磷酸化抗体芯片技术，从发现靶器官肠绒毛隐窝开始，逐层深入探索，最终找到了肠绒毛衰老的核心调控通路。同时，为临床治疗衰老导致的营养不良等症状提供了潜在治疗靶点和药物。该研究不仅紧扣社会现象，为解决临床问题提供了扎实的理论基础，也为信号通路研究提供了经典科研设计范本，值得4008云顶国际视角推荐。

英文原文：He D, Wu H, Xiang J, et. al. Gut stem cell aging isdriven by mTORC1 via a p38 MAPK-p53 pathway.NatCommun. 2020 Jan 2;11(1):37.